公海710官网是由黄单胞菌发酵产生的一种胞外杂多糖11]，微波诱变筛选无色素公海710官网产生菌，是目前世界上生产规模最大且用途极为广泛的微生物多糖。 由于黄单胞菌在发酵生成公海710官网的同时会产生黄色素，影响 公海710官网质量，要消除黄色素须增加多道工艺，增加成本，同时 加大污水处理难度12]。因此，筛选出含色素较少或无色素的 公海710官网生成菌株，生产高品质的透明公海710官网，对公海710官网发酵 工业的发展具有重要的现实意义。 i材料与方法 11材料

1 1. 1仪器与试剂。微波炉（格兰仕P70D20TJD3);摇床 (SKY-211B)

11.2试验菌株。从全国各地分离采集的22株黄单胞菌 菌株：cM26~ccM47株。

11. 3培养基。NYGB培养基。酵母浸膏0 3 g牛肉浸膏

0 5 g蔗糖2 g蒸馏水K)0ml pH值7. 0 NYGA培养基固 体培养基）在NYGB中加入1 2 ~1. 5的琼脂粉。

12方法

12 1出发菌株的分离筛选。

12 1. 1出发菌株的初筛。将菌株活化后接入6 ml液体培 养基，28 °C、200 rmn摇床培养16 h培养后的菌液在振荡 器上振荡摇匀，取10 5、10 6、10 7稀释液100 P1 涂布NYGA 平板各2个，28 C培养5 d

野油菜黄单孢菌的产胶能力与菌落大小呈正相关，即小 菌落产胶量小，黏度低，大菌落产胶量高，黏度大[3]。该试验选择每一个平板中菌落形状较大、比较饱满光滑的菌落测量 其直径大小，挑选出菌落直径最大的1个菌株，点平板;将同 一菌株培养的6个平板中各平板的直径最大菌落的菌株都 点接在同一个NYGA平板上，28 C培养5 d从该平板中选 出直径最大菌落的1个菌株，培养、保存。

1. 2 1 2出发菌株的复筛。将初筛得到的菌株分3批进行 复筛，一批取7 ~8个菌株点接在同一个NYGA平板上，28 C 培养5 d观察、测量各菌落直径，进行比较。选取直径最大 的2个菌落的菌株，培养、保存。

1. 2 1 3出发菌株的二次复筛。将复筛所得全部菌株点接 在同一个NYGA平板上，28 C培养5 d观察、测量各菌落直 径，选取直径最大的1个菌落作为出发菌株，培养、保存。

12 2微波诱变。

1.22 1微波照射诱变方式。①照射源采用脉冲频率为 2 450MHZ输出功率为700 W的微波炉。以微波炉全功率 输出为微波强度100%微波炉的火力档有5档，各档微波强 度分别为20% 40% 60% 80% 100%将黄单胞菌caM45 菌株分别置于微波强度为40% 60%、80%的微波炉中进行 诱变，微波诱变筛选无色素公海710官网产生菌，分析微波照射强度与致死率的关系。②选择10 5、 10 6、10 7 3个稀释度，用不同的微波照射时间进行微波照射 诱变;③微波照射中每照射10 s后就冷却1次（水水浴冷却1 mn以除去热效应）每个处理的微波照射时间总计为40 s 将微波诱变过程中冷却和不冷却的诱变菌液、对照菌液稀释 分别涂布后计算单菌落，计算致死率。所有诱变处理均以不 经微波诱变处理为对照。

1 2 2 2诱变。液体培养16 h的菌液，经微波照射后按 “ 1 2 1”的方法稀释涂布NYGA平板，倒置于28 C培养箱中 培养2 ~3 d 1.. 3致死率计算公式。

致死率=射照每毫升的cii数一处理后每毫升的cfU 数）尉照每毫升的cfh数X 100%⑴

式中，cf!数为平板上生长的菌落数。

1.3目标菌株的筛选。经过微波诱变，在NYGA培养基 平板上选择圆形、凸起、光滑湿润、有黏连的无色或浅色的黄 单胞菌菌落，在固体培养基上点板培养，观察。

1.4突变株性状观察。革兰氏染色后用显微镜观察，将 菌落无色或呈浅色的黄单胞菌突变株连续传代培养4次，观 察传代后生长的菌落形态。

1.5公海710官网的提取。称取适量发酵液于10 000 r/nh转 速下离心30m迫取上清液，加入2 ~7倍体积的浓度95%乙 醇，边加边搅拌。在搅拌过程中，玻棒上会慢慢有絮状物聚 集，待絮状物聚集完之后，将絮状沉淀捏干，于烘箱中干燥， 观察公海710官网的颜色。

2结果与分析

2 1出发菌株的确定经初筛、复筛、二次复筛，获得的 caM26 ~caM47株的菌落直径大小排序如下：ctM45> caM46 〉caM28〉caM44〉cM42> caM40〉caM4^ CEM 30〉caM33 > caM43> caM3^> cM37> caM29> caM39> aM41> caM38 〉caM34〉caM3^> caM36> caM2^> cM31〉caM26 观察菌 落直径大小和菌落形态，挑取直径最大，光滑、湿润、黏稠的 caM45株（菌落直径14 60mm)作为诱变出发菌株。

22微波诱变及最佳条件的选取

2.1微波照射时间与致死率的关系。由表1可知，诱变 时间与致死率之间存在明显的剂量关系，诱变处理时间越 长，致死率越高。一般认为，致死率为50% ~60%的诱变效 果较好，能获得更多的正变菌株。致死率在50% ~60%区间 的是56 8%致死率，其诱变时间为40 s时，故而选择40 s作 为微波诱变最佳处理时间。

表1微波照射时间与致死率的关系 Table 1 ReJatioiship betveei mciDwave rindiatich tm eand mortali¬

ty

处理时间// s Tieatmeit tine存活菌落数//个/ml Nunber of survived colonies存活率//%

Survival rate致死率/% Mortality

302 27X 10854 845 2

401 79X 10843 256 8

501 52X 10836 763 3

对照CK4 14X 109100 00

2.2微波照射强度与致死率的关系。微波照射的强度不 同，微波诱变筛选无色素公海710官网产生菌，诱变效应也不同，在一定照射时间内，致死率随着微波照 射强度的增加而增加。由表2可知，当微波强度为60%时， 致死率为57 6%,落入致死率50% ~ 60%区间，所以选择微 波强度为60%作为最佳微波强度进行微波诱变。

2.3微波诱变过程是否冷却与致死率的关系。由表3可 知，在微波强度一定、照射时间一定的条件下，诱变过程经冷 却后可除去其热效应，冷却之后涂板的菌落数要比不冷却的 多，而且生长状况要比不冷却的好，且其致死率落入50% ~ 60%区间，故而选择照射过程冷却方式为最佳微波诱变 方式。

表2微波照射强度与致死率的关系

Table 2Relatonshp betwenmicrowaveirradiationntensity and

m ortality

微波强度/ M icowave intensity存活菌落数//个/ml Number of survived colcnies存活率//% Survival rate致死率//% M ortality

403 56X 10861 238 8

602 47X 10842 457 6

801 33X 10822 977 1

对照CK5 82X 109100 00

表3微波诱变过程是否冷却与致死率的关系 Table3 ReJationshp betweei the colhg and non-coolhg during the microwave irradiation process and mortality

组别 G oup存活菌落数//个/ml N umber ff survied colonies存活率//% Survival rate致死率//% M ortality

冷却 Cooling2 91X1rf46 653 4

不冷却 Non-ccoling2 33X 1rf37 362 7

对照 CK6 24X 1Cf100 00

23浅色黄单胞菌突变株的筛选从诱变各个试验组的菌 液稀释后涂布的平板中共获得诱变后的单菌落5 610个，通 过对单菌落颜色的肉眼判断，经过各个平板内比较、各个稀 释度内比较、各个试验组内比较、各种条件试验内的单菌落 颜色比较，最终选得1株圆形、凸起、黏稠、颜色较浅的白色 黄单胞菌突变株，命名为caM45-5。

24浅色黄单胞菌突变株性状观察和比较经革兰氏染色 后于显微镜下观察可知，突变株caM45-5呈紫色，为革兰氏 阳性菌，其菌体特征、染色特征均与出发菌株caM45相同；突 变株caM45 -5点板后培养的菌落呈圆形、凸起、黏稠、白色， 除颜色与出发菌株caM45的黄色不同外，其余的菌落特点与 caM45相似賴1)由此可以初步确定该突变株为黄单胞菌 突变株。

将突变株caM45-5点板传代培养4代后观察菌落形态， 微波诱变筛选无色素公海710官网产生菌，均为圆形、凸起、黏稠、白色的菌落，与第1代菌落特点一致， 由此可知其浓度的增加而增加；当铅浓度为200 mg/kg时，2个小麦品种 茎秆中钾的含量分别是铅浓度为1⑴mg/kg时的1.25 1 07 倍;当铅浓度超过200mg/kg时，2个小麦品种茎秆中钾的含 量整体上呈下降趋势。铅胁迫条件下，2个小麦品种茎秆内 磷的最小含量与其最大含量相比分别下降了 3& 78%和 53. 68%;且当铅浓度大于200mg/kg时，宁春13号茎秆内磷 的含量也出现了下降趋势。这说明200mg/kg可能为铅胁 迫影响小麦养分分布的临界浓度，超过该浓度铅胁迫会在一 定程度上抑制小麦的生长和发育。

表1不同浓度铅胁迫下小麦叶片中氮、磷和钾的含量 Table 1 The contents ofN P and K in wheat leaves under different

ccncentmtiai of Pb%

施铅量

mg/kg宁春13号 NingchuiNo 13宁春4号 N No 4

Pb application am aunt氮N磷P钾K氮N磷P钾K

02.640 460 693 020 540 93

1003 .280 561 044 490 671 23

2003 .630 541 065 060 971 03

4003 .940 541 135 660 710 96

5003 .280 551 103 720 861 23

8004.020 621 163 860 781 34

表2不同浓度铅胁迫下小麦茎秆中氮、磷和钾的含量

Table 2 T he contoits ofNP and K nwheat stalks under different

concentration ofPb%

施铅量

mg/kg宁春13号 NingchuiNo 13宁春4号 N No 4

Pb application amamt氮N磷P钾K氮N磷P钾K

03.310 531 502 450 561 34

1003 .250 681 502 750 951 44

2002.320 981 882 840 491 55

4002.550 751 522 910 621 34

5002.500 601 522 680 441 43

8002.520 751 652 260 901 68

2.3对小麦养分积累量的影响。氮、磷和钾是植物生长 所必需的大量元素，微波诱变筛选无色素公海710官网产生菌，也是植物体内许多重要化合物的组成部 分，并参与植物体内多种重要的代谢活动。作物的营养元素 通过作物根系吸收后在作物的体内积累。作物体内氮、磷和 钾的含量反映了作物对营养物质的利用效率171。由表3可 见，不同浓度铅胁迫对2个小麦品种的养分积累影响较大。 2个小麦品种氮、磷和钾的积累量在铅浓度为0 ~200mg/kg 时整体上呈上升趋势，而在铅浓度为2ro ~ 8⑴mg/kg时整 体上呈明显下降趋势，说明较高浓度（⑴~8⑴mg/kg)的铅 胁迫使2个小麦品种的生理生化活性严重受阻，从而影响了 其对氮、磷、钾的积累，可能导致作物产量和品质的下降。

表3铅胁迫对小麦养分积累量的影响 T able3 Effect ofPb stress cn nutrients accunuJation in wheat g/株

施铅量

mg/kg宁春13号 NinghmNo 13宁春4号 NinghunNo 4

Pb application amomt氮N磷P钾K氮N磷P钾K

000280 03900680 1790 0320 034

10000310 04200700 2000 0330 035

20000650 04900940 2290 0330 039

40000400 03700780 1330 0240 029

50000340 03200650 1270 0280 034

80000420 04000790 0940 0180 023

3结论

植物吸收过量的铅会影响其正常生长。该研宄表明，随 外源铅浓度的增加，微波诱变筛选无色素公海710官网产生菌，2个小麦品种的株高均呈下降趋势，说明 铅胁迫一定程度上会抑制小麦的生长发育。在低浓度铅（小 于200mg/kg处理下，2个小麦品种的鲜、干重均随外源铅 使用量的增加而呈增加趋势，而当铅浓度超过200mg/kg时 均整体上呈下降趋势。在相同施肥水平条件下，铅胁迫环境 下的2个小麦品种根冠比均小于不施铅水平，且在铅胁迫条 件下宁春13号品种的抗逆性略优于宁春4号。在铅胁迫环 境下，较高浓度（⑴-800 mg/kg)的铅使2个小麦品种的生 理生化活性严重受阻，从而影响了对氮、磷和钾的积累，可能 导致作物产量和品质的下降。